细胞低血清培养介绍 － 丁香通

1.1 细胞的体外培养细胞培养是指细胞在体外条件下的存活或生长，是一种应用最为广泛的体外培养技术。由于体外培养技术最初是从培养组织发展而来的，所以动物学和医学上往往用“组织培养”这一术语来泛指一切可以使细胞、组织、器官在适当的培养条件下离体生长的技术。动物组织培养的技术起源于19世纪所应用的若干胚胎学技术。1885年W.鲁把鸡胚的神经板在温热的盐水中成功地维持存活了若干天，是首次体外培养的尝试。1907年美国胚胎学家R.G.哈里森的实验是组织培养真正开始的标志，他把蛙胚神经管的一小片组织移植到蛙的凝结的淋巴液中，这小片组织不但在体外存活了若干星期，还从细胞中长出了轴突，从而解决了关于轴突起源的争论，表明了利用体外存活组织进行实验的可能性。随后，法国生物学家A.卡雷尔把外科无菌技术引进组织培养技术，他从一个鸡胚心脏组织开始，将不断铺出和增殖的细胞系统地传代，在完全没有抗菌素的条件下维持了34年。随着抗菌素、合成培养液、胰蛋白酶处理技术的发展以及器皿的改进，动物组织培养技术得到了飞速的发展。其间，W.厄尔首创了从单个细胞进行克隆培养的方法，并第一次有意地进行了悬浮培养的尝试；盖伊等于1952年建立了最早的上皮型的人的连续性细胞系之一即人子宫颈癌细胞系（HeLe细胞系）。作为现代生物技术的核心基础技术，细胞培养技术广泛用于生物技术的各个领域，特别是现代生物医药技术领域，目前，绝大多数的疫苗、抗体、重组基因工程蛋白类药物等生物医药产品的生产均依赖于细胞培养技术。

1.2 血清在细胞培养中的作用 血清对于在传统培养基配方中生长和增殖的大多数细胞系来说是需要的，因为大多数单独的培养基并不能提供细胞生长所需要的全部营养，如MEM培养基，较为常用的量为8％～10％的比例，而特殊的低血清培养基血清量可降至3％左右，细胞的形态和功能不受影响。用于细胞培养的血清主要是牛血清，培养某些特殊细胞也用人血清、马血清等。选择用牛血清培养细胞的原因主要是来源充足、制备技术成熟、经过长时间的应用考验人们对其有比较深入的理解。牛血清分为小牛血清、新牛血清、胎牛血清。小牛血清取自出生10～30天的小牛；新牛血清取自出生24小时之内的新生牛；胎牛血清应取自剖腹产的胎牛。显然，胎牛血清是品质最高的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。牛血清对绝大多数哺乳动物细胞都是适合的，但并不排除在培养某种细胞时使用其他动物血清更合适。牛血清中含有丰富的细胞生长必须的营养成份，具有极为重要的功能。血清是非常复杂的混合物，成分多样，有的对细胞生长有促进作用：提供基本营养物质，如氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等，是细胞生长必须的物质；提供激素和各种生长因子，如胰岛素、肾上腺皮质激素、类固醇激素（雌二醇、睾酮、孕酮）、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等；提供结合蛋白，可携带重要的低分子量物质，如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等，转铁蛋白携带铁，在细胞代谢过程中起重要作用；血清能提供促接触和伸展因子，使细胞贴壁免受机械损伤，对培养中的细胞起到某些保护作用；血清中还含有起稳定作用和解毒的因子，能够维持培养基的pH 值并抑制蛋白酶直接或间接的酶解。血清还能够帮助细胞粘附到培养表面，可能通过提供粘附过程涉及的外源糖蛋白起作用。 但是血清的加入也带来了很多问题：血清的成份可能有几百种之多，目前对其准确的成份、含量及其作用机制仍不清楚，尤其是对其中一些多肽类生长因子、激素和脂类等尚未充分认识，这给研究工作带来许多困难； 血清都是批量生产，各批量之间差异很大，因此，要保证每批血清的相似性极为困难，从而使实验的标准化和连续性受到限制；对大多数细胞，在体内状态，血清不是它们接触的生理学液体，只是在损伤愈合以及血液凝固过程中才接触血清，因此使用血清有可能改变某种细胞在体内的正常状态，血清可能促进某些细胞的生长（成纤维细胞）同时抑制另一类细胞生长（表皮细胞）；血清含一些对细胞产生毒性的物质，如多胺氧化酶，能与来自高度繁殖细胞的多胺反应（如精胺、亚精胺）形成有细胞毒性作用的聚精胺，补体、抗体、细菌毒素等都会影响细胞生长，甚至造成细胞死亡；血清取材中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响；大规模生产中，血清来源越来越困难，价格昂贵，是构成生产成本的主要部分之一。

1.3 细胞的低血清培养 在细胞培养过程中，血清浓度常常是可以降低到传统培养特定类型细胞的水平之下的，从而实现细胞的低血清培养。细胞经较低浓度的血清适应传代后，可适应低血清浓度而良好的生长，细胞的生长状态和生长速度没有明显影响。对于细胞的低血清培养技术，国际上在上世纪就有相关方面的研究。在我国，“低血清与无血清细胞培养技术的研究与应用”已被列入“十一五”国家科技支撑计划重点项目——动物疫苗关键生产技术研究与开发。 与传统的高血清含量的细胞培养相比较，使用低血清进行细胞培养具有明显的优点。在细胞的低血清培养基中，由于不含血清替代物、动物来源蛋白、以及植物蛋白、酵母水解物，因此保证了细胞培养中原辅料的使用安全性；在细胞培养阶段不需要使用水解乳蛋白，支持低血清培养，可使血清含量可降低到3％～5％，显著降低培养液成本并提高产品质量；在低血清培养状态下，虽然降低了血清的使用量，但细胞更易培养，细胞生长速度快、形态健壮、活力更强。

1.4 BHK21细胞的低血清培养 BHK21细胞是幼年叙利亚地鼠肾细胞（Baby Hamster Syrian Kidney）。1961年3月，I.A. Macpherson 和 M.G.P. Stoker从一日龄叙利亚地鼠肾分离建株，经过84天连续培养，获得单细胞克隆细胞，即clone 13或C13。BHK21细胞广泛用于增殖各种病毒，已成为制备口蹄疫疫苗所需病毒抗原的理想细胞培养系，应用于口蹄疫疫苗生产，之外还可用于生产狂犬疫苗等其它兽用疫苗。BHK21细胞染色体分布频率是n＝44，为异双倍体细胞系，4倍体发生率为4％，大多数细胞核型分析为44，XY，-6，-15，6q+，15q+。原始的BHK21细胞株为成纤维细胞，属于贴壁依赖性细胞，后经无数次传代后细胞可悬浮生长。美国ATCC保存BHK21细胞株，编号为CCL-10，为C13克隆株。对于BHK21细胞， ATCC推荐使用的培养方式为：使用含10％胎牛血清的MEM培养基进行细胞培养，细胞培养温度为37.0°C，细胞培养后使用0.25％胰酶和0.03％EDTA消化细胞，细胞分种比例为1：2－1：10，每周1－2次细胞传代。

ATCC提供的BHK21细胞培养照片

BHK21细胞可使用方瓶或转瓶进行细胞培养，对于生物制药企业，多使用15L转瓶进行细胞培养。转瓶生产制备BHK21细胞的主要问题在于如何避免污染，以及细胞良好生长与传代。与原代细胞以及二倍体细胞比较，BHK21细胞更容易控制与培养，由于BHK21细胞生长速度较快，可进行大比例分种培养。营养BHK21细胞转瓶培养效果的因素较多，比如细胞消化液的选择、细胞培养操作程序的使用，但做为重要的生物制药原材料，细胞培养基对细胞培养效果的重要性得尤为突出。细胞培养基不仅为细胞的生长提供必要的各种营养成分，还为细胞培养提供适宜的环境，而且，在利用细胞进行生物制药时，培养基的成分可直接影响制药产品的质量。BHK21细胞可使用多种细胞培养基进行培养，最广泛适用的培养基为MEM培养基，使用的血清含量为10%。在转瓶生产口蹄疫疫苗中，常将乳汉液和MEM按1：1的比例混合进行细胞培养，该细胞培养方式是上世纪建立的方法，具有悠久的使用历史。然而该传统模式下制备的疫苗，往往生产成本较高，并且具有较严重的免疫接种副反应发生。随着生物技术的不断进步，人们对生物安全性的逐步重视，以及生物制药企业对生物制品的产率和生产成本提出了更高的要求，高浓度的血清以及水解乳蛋白在疫苗生产中的使用，所带来的产品质量和使用安全性问题，以及较高的生产成本问题，逐步显现出来。因此，在BHK21细胞生长中使用低浓度血清进行培养具有重要意义。BHK21细胞可使用清大天一的MD611低血清培养基进行培养，血清含量可降低到2%-3%浓度，可实现细胞的低血清培养，并可改善细胞的培养状态，更利于细胞的贴壁和生长，有助于生物制药领域中BHK21大规模培养的效果提高和生产成本的显著降低。在使用BHK21低血清培养基进行转瓶培养工艺中，由于培养基对细胞的培养特性有所改变，以及降低血清后而引起的细胞培养条件的改变，低血清培养的方式与传统培养基培养细胞方式相比较存在一定的差异，主要表现在细胞贴壁状态和细胞的生长状态，如降低血清后细胞更易漂浮，以及细胞生长代谢旺盛而引起的细胞培养液更易变酸，造成对细胞培养和传代效果影响，但这些都可以通过改变细胞培养的条件和控制培养条件加以改善，生物制药企业工业化规模在口蹄疫疫苗制备中的使用就是很好的例证。

BHK21细胞低血清培养照片（MD611培养基）

1.5 Vero细胞的低血清培养Vero细胞是成年非洲绿猴肾细胞（Adult African Green Monkey Kidney ）。上皮细胞，贴壁依赖性生长。该细胞是日本千叶大学的Y. Yasumura和Y. Kawakita于1962年3月27日从一只正常的成年非洲绿猴肾组织培养出来的。其可增值多种病毒，如脊髓灰质炎、狂犬病毒、乙脑病毒等，生产疫苗，被批准用于人体。也可作为转染的宿主细胞，用于表达外源基因的蛋白质药物和病毒的检测。在非典期间又为研究冠状病毒做出贡献，在医药研究中广泛应用。美国ATCC保存Vero细胞株，编号为CCL-81。对于Vero细胞， ATCC推荐使用的培养方式为：使用含10％胎牛血清的MEM培养基进行细胞培养，细胞培养温度为37.0°C，细胞培养后使用用0.25% (w/v) 的胰酶和0.53 mM EDTA消化细胞，推荐的细胞分种比例为1：4，传代期间，每周更换培养液2～3次。Vero细胞可使用方瓶或转瓶进行细胞培养，对于生物制药企业，多使用15L转瓶进行细胞培养。转瓶生产制备Vero细胞的主要问题在于如何避免污染，以及细胞良好生长与传代。与原代细胞以及二倍体细胞比较，Vero细胞更容易控制与培养，由于Vero细胞生长速度较快，可进行大比例分种培养。营养Vero细胞转瓶培养效果的因素较多，比如细胞消化液的选择、细胞培养操作程序的使用，但作为重要的生物制药原材料，细胞培养基对细胞培养效果的重要性得尤为突出。细胞培养基不仅为细胞的生长提供必要的各种营养成分，还为细胞培养提供适宜的环境，而且，在利用细胞进行生物制药时，培养基的成分可直接影响制药产品的质量。Vero细胞可使用多种细胞培养基进行培养，使用的血清含量通常为10%。

ATCC提供的VERO细胞培养照片

Vero细胞经较低浓度的血清适应传代后，可适应低血清浓度而良好的生长，细胞的生长状态和生长速度没有明显影响。Vero细胞可使用清大天一的MD504培养基或MD611培养基进行低血清培养，使用的血清含量可降低到3%-5%。

Vero细胞低血清培养照片（MD504培养基）

1.6 影响细胞低血清培养的因素由于在细胞培养过程中使用了低浓度的血清，细胞的低血清培养比常规血清培养更难控制，需要在培养过程中严格控制细胞培养条件和操作过程。影响细胞低血清培养效果的因素很多，包括细胞贴壁性、细胞的质量、细胞培养基、细胞培养条件控制、污染控制等方面。1.6.1 细胞贴壁性对于体外培养的细胞，按细胞贴壁的性质差异可分为两类，贴壁依赖性细胞和非贴壁依赖性细胞。贴壁依赖性细胞在培养时需要贴附在支持物表面生长，而非贴壁依赖性细胞可不依赖于支持物表面进行悬浮培养。对于贴壁依赖性细胞，细胞的贴壁伸展过程在细胞的生长增值中具有重要的作用。细胞在支持物表面的贴壁过程可分为三步，贴壁因子粘附、细胞开始粘附、细胞进一步牢固附着并伸展，同时细胞形态由圆形变为圆饼形（放射状铺伸细胞），并逐渐展开伸展为扁平的极性细胞。细胞伸展为扁平的极性细胞，有利于增加细胞于营养环境的营养物质交换表面积，之外只有当细胞伸展到合适状况，细胞DNA才开始合成，细胞伸展状况制约了细胞的分裂增殖活动过程。因此，细胞贴壁伸展的速度，对于贴壁细胞的生长也是重要因素之一，传代细胞贴壁伸展的越快，细胞进入生长期的时间也就约早，这样有利于细胞的生长。除了细胞与支持物表面的贴附之外，细胞与细胞之间的粘附是最重要的过程之一。细胞间的连接有三种类型：封闭连接，通信连接和贴壁连接。封闭连接或者密封连接可以通过阻止分子从一侧渗漏到另一侧的方式将细胞密封在上皮细胞层内。通信连接介导着两个相互影响的细胞间的化学或电信号的传递。贴壁连接，是最有意义的一个，机械地将细胞贴附到与它们相邻的细胞或胞外基质上去。贴壁连接共有四种不同的类型：包括细胞与细胞之间的粘附连接、细胞与基质之间的粘附连接、细胞桥粒、以及半桥粒。贴壁连接常常形成一个连续的粘附带。细胞的贴壁连接是依靠细胞内、细胞膜、以及细胞基质层一系列蛋白共同完成。细胞内和细胞膜上与细胞贴壁连接有关的蛋白包括连环蛋白(Catenins)、钙离子依赖性粘附素（cadherins）、选择素（selectins）等，这些蛋白功能的实现大多依赖于钙离子的存在。细胞基质在细胞贴壁连接中占有重要作用，它由两大类主要的胞外大分子组成，包括糖胺聚糖和纤维蛋白。纤维蛋白按功能分为两类，结构蛋白（例如，胶原和弹性蛋白）和粘连蛋白（例如纤粘连蛋白和层粘连蛋白）。胶原是体内胞外基质中的主要蛋白质，依靠粘连蛋的介导，细胞紧密地粘附在胶原结构上。细胞贴壁连接中另一类重要的蛋白是整合素，它们是动物细胞用于结合到胞外基质中去的最主要的受体。细胞粘附是一个多步骤的过程，包括最初细胞与表面的接触，细胞在表面的伸展，以及细胞的分化或生长。贴附涉及到跨膜粘附受体（例如钙粘素，整合素和神经细胞粘附因子）和吸附的粘附蛋白（如纤粘连蛋白fibronectin, 玻璃粘连蛋白vitronectin, 层粘连蛋白laminin）之间键的形成。在细胞粘附过程中，钙离子和镁离子是许多粘附蛋白的辅因子。因此，降低培养基中钙离子的浓度可以减弱细胞的粘附。在细胞的低血清培养过程中，由于降低了使用血清含量，从而降低了血清中有利于细胞贴壁性的物质，使得细胞贴壁性能的降低，从而导致细胞正常贴壁生长受到影响，这是细胞在低血清环境中培养的最为重要的影响因素。调整培养基中的营养成份并调整细胞培养的控制方式，可在低血清培养状态下，保证细胞的正常贴壁性能，实现细胞的低血清培养。对于细胞的低血清培养，影响细胞贴壁性的另一个重要因素使用的细胞培养瓶的质量。在进行BHK21细胞低血清培养研究中我们发现，使用过的旧瓶子培养BHK21细胞时细胞更容易发生脱落，而使用新瓶子进行培养时细胞能良好生长。我们将BHK21细胞使用3%含量血清的MD611进行细胞传代培养，不同时间进行细胞培养效果的比较观察，细胞培养照片如下。

旧瓶子BHK21细胞培养24小时照片               旧瓶子培养BHK21细胞48小时照片新瓶子BHK21细胞24小时照片                 新瓶子BHK21细胞48小时照片新瓶子BHK21细胞72小时照片

使用旧瓶子培养BHK21细胞，与新瓶子比较，在接种细胞后，新瓶子的细胞贴壁和伸展的更快，培养24小时，新瓶子细胞明细增殖，但就瓶子较多的细胞依然是未完全伸展的椭圆形细胞；培养48小时后，新瓶子细胞生长为较为致密的单层，而使用旧瓶子培养的细胞，细胞已经出现收缩脱落；继续培养至72小时，使用新瓶子培养的BHK21细胞，细胞只是出现细胞间间隙加大，但没有园缩脱落现象。为了验证细胞瓶对细胞贴壁性能的影响，我们又用不同的细胞系293细胞进行了相同的比较试验，细胞培养结果见下图。使用老的细胞瓶培养293细胞，细胞成团而分布不均匀，细胞没有良好伸展生长；不同的试验结果出现在使用新的细胞瓶培养，细胞分布均匀而其伸展生长良好。该试验结果验证了老瓶子对细胞贴壁性能以及细胞维持性能的降低。

旧瓶子培养293细胞24小时照片                    新瓶子培养293细胞24小时照片

细胞瓶表面做为细胞贴壁伸展的基质，其性质对细胞的贴壁性十分重要。而进行BHK21细胞低血清培养时，由于BHK21细胞贴壁性能的减弱，细胞瓶的质量对细胞贴壁生长的影响就越加明细。经常使用的细胞瓶，可能由于频繁的洗刷而影响细胞的贴壁性。我们观察到一个特殊的细胞瓶培养的细胞，细胞在视野中呈十字交叉生长，细胞照片如下，推测为洗刷细胞瓶时毛刷形成的划痕，十字划痕内由于洗刷接触的少而保持了良好的细胞贴壁性能，但划痕外的大多数瓶壁由于经常洗刷而逐渐丧失了细胞贴壁性。

特例细胞瓶培养照片

通过以上的各项试验证明，细胞瓶表面特性对于BHK21细胞低血清培养成功的重要作用，对于大规模的转瓶培养生产中，我们认为细胞瓶的质量尤为重要，转瓶低血清培养的失败，很可能与使用的旧瓶子对细胞贴壁性能的降低有直接关系。1.6.2 细胞培养基使用低血清含量进行细胞培养时，使用的培养基不同于传统的199或MEM培养基，因为在低血清培养条件下，必须改良细胞培养基的成分，增加细胞的贴壁性并提供丰富的营养成分，才能使细胞在低血清条件下良好生长。清大天一的MD611培养基是在MEM基础上改良的低血清培养基，可用于BHK21细胞和Vero细胞的低血清培养，MD504培养基是在199基础上改良的低血清培养基，可用于Vero细胞的低血清培养。低血清培养基不同于传统的培养基，正确的使用方法直接影响细胞的低血清培养效果，比如碳酸氢钠的使用量。对于MD611培养基，按标示量加入碳酸氢钠（2.2g/L），培养液pH应为7.2～7.4，在使用滤器除菌过滤以及培养基储存过程中，培养基的pH会升高，其次，使用15L转瓶进行细胞培养时，加入的细胞培养液由于二氧化碳的释放，pH还会进一步升高。在使用MD611培养基进行BHK21细胞低血清培养基，有使用者希望通过减少配液时碳酸氢钠的使用量来降低培养基的初始pH。为了比较碳酸氢钠减少对BHK21细胞低血清培养的影响效果，本实验室使用方瓶和转瓶进行了试验研究。低血清适应BHK21细胞，分别使用含1.1g碳酸氢钠的MD611培养基，以及含2.2g碳酸氢钠的MD611培养基，进行细胞培养，连续观察细胞培养效果。方瓶试验结果表明，使用含2.2g碳酸氢钠培养基培养的BHK21细胞，不论在24小时还是48小时，细胞形态均良好，而使用含1.1g碳酸氢钠培养基培养的BHK21细胞，通常在24小时细胞形态良好，但于24小时至48小时之间，细胞出现明显收缩脱落现象，且其培养基PH较低。试验结果见下列BHK21细胞照片。在使用含1.1g碳酸氢钠培养基培养的BHK21细胞时，由于培养基初始PH较低，导致细胞培养至24小时后培养基PH下降过快、过低，PH是影响BHK21细胞收缩脱落的重要因素之一。

2.2g碳酸氢钠液体培养BHK21细胞24小时照片 1.1g碳酸氢钠液体培养BHK21细胞40小时照片

为进一步验证试验结果，我们使用3L转瓶重复了比较试验，试验的细胞培养照片如下。

2.2g碳酸氢钠液体培养BHK21细胞18小时照片   1.1g碳酸氢钠液体培养BHK21细胞18小时照片

2.2g碳酸氢钠液体培养BHK21细胞48小时照片  1.1g碳酸氢钠液体培养BHK21细胞48小时照片

转瓶的试验结果再次证明，使用含1.1g碳酸氢钠的MD611培养基培养细胞，会导致培养后期PH显著降低，致使细胞脱落，影响细胞的低血清培养效果。以上试验说明，配制MD611细胞培养基时，将碳酸氢钠含量降低，会明显降低BHK21细胞低血清培养的效果。1.6.3 血清在低血清浓度下要得到良好的细胞培养，维持合适的培养条件尤其重要。血清是细胞培养的重要因素，血清能够帮助细胞粘附到培养物表面，细胞培养时血清使用量的降低会影响细胞贴壁性以及细胞生长。影响细胞培养成功和重复性的一个最重要的因素是特定类型血清批次间的变异。由于国内血清产品质量不稳定，不同厂家不同批号来源的血清成分存在很大的差异，血清批间的差异成为影响细胞低血培养成功和重复性的一个最重要的因素。因此，在进行细胞低血清培养时，应控制使用血清的质量。参照2005年版《中国药典》中关于小牛血清的质量要求，可使用Sp2/0-Ag14或适宜的非贴壁传代细胞进行细胞增殖的检查，包括细胞生长曲线的测定、细胞倍增时间的测定、以及细胞克隆率的测定。细胞生长曲线和细胞倍增时间的测定试验，检查的是相对较多细胞时的群体细胞的生长支持性，而细胞克隆率的测定检查的是血清对单一存在状态的生长支持性。血清质量方面的问题，往往在于细胞生长曲线和细胞倍增时间的检测合格，而克隆率检查不合格，应引起足够的重视。在BHK21细胞低血清培养质量控制中，使用BHK21细胞来检查血清的质量可能更有实际意义。常用的有以下三种方法。使用待检血清配制的细胞培养液，方瓶静止培养BHK细胞，观察细胞生长状态以及细胞生长速度。该方法简单易操作；使用待检血清配制的细胞培养液，转瓶连续培养BHK细胞，观察细胞贴壁性能、生长状态、以及生长速度。该方法更接近实际使用情况；使用待检血清配制的细胞培养液，采用有限稀释法进行BHK21细胞克隆性生长检查。该方法对筛选高质量的血清尤为重要。对于BHK21细胞低血清培养中使用血清检验，建议使用低血清适应的细胞进行，但也可以使用常规血清含量进行检查。1.6.4 细胞培养条件细胞在体外条件下实现良好的存活与生长，就要求人工模拟细胞在体内生长的营养环境、提供维持细胞生长的营养物质，因此，细胞在体外培养的条件对于细胞培养及其重要。细胞在体外培养所需条件包括，足够的营养保证、细胞代谢有害产物的清除、适宜的外界环境等。细胞培养基是为细胞培养提供营养的物质基础，细胞培养基的主要营养成分包括氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。在使用细胞培养基培养细胞时，还需添加10%的小牛血清，才能使细胞很好地贴壁与增殖。小牛血清促进细胞贴壁增殖原因在于：1、提供有利于细胞生长增殖所需的各种生长因子和激素；2、提供有利于细胞贴壁所需的贴附因子和伸展因子；3、提供可识别金属、激素、维生素和脂类的结合蛋白；4、提供细胞生长所必需的脂肪酸和微量元素。在细胞低血清培养过程中，由于小牛血清含量的减少，势必会影响细胞的贴壁和增殖效果，因此，仅仅使用传统的培养基，如EME培养，进行细胞低血清培养，效果并不理想。为了改善低血清培养的效果，通常需要设计具有针对性的培养基，增加细胞培养基中的有效成分，促进细胞的贴壁和增殖性，以此来抵消降低血清所带来的不利影响。动物细胞的生长与维持依赖于细胞对营养物质的代谢，细胞代谢的主要营养成分为葡萄糖和氨基酸，葡萄糖提供细胞生长的碳源需求，氨基酸为细胞生长提供氮源。细胞通过无氧呼吸以及有氧呼吸将葡萄糖代谢为乳酸或丙酮酸和二氧化碳，代谢氨基酸产生氨。二氧化碳和乳酸的积累导致细胞培养液的pH下降，最终影响细胞的生长和维持。氨的积累对细胞具有直接的毒害作用，影响细胞的生长以至细胞死亡。因此，细胞代谢产物有效去除对细胞的良好生长具有重要作用。在细胞低血清培养过程中，由于使用营养成分丰富的改良培养基，细胞代谢更加旺盛，所产生的细胞代谢有害物与传统培养基比较增多，同时，由于血清含量的减少，降低了血清对细胞的保护作用，导致细胞对代谢有害物质敏感性增强，因此，代谢有害物的去除对低血清培养就显得更加重要。对于BHK21细胞转瓶低血清培养，及时换液是清除细胞代谢有害物的最有效的途径。细胞体外培养的外界环境中，pH是细胞低血清培养的关键性因素之一，它能影响细胞的粘附、存活与生长等功能。在培养过程中，细胞的形态与pH有相关性，在高pH环境中，细胞伸展的良好，形态倾向于菱形和多边形，但在低pH环境中，细胞出现收缩趋势，细胞形态拉长，间隙增大。高pH环境有利于细胞在支持物表面的贴附，而低pH环境则导致游离细胞的产生。因此，细胞培养液的pH降低，不利于细胞的贴壁生长，这种现象在细胞低血清培养中更加明显。此外，较低的pH环境还会直接影响细胞的活性，导致细胞的死亡。对于使用方瓶进行细胞静止培养，可通过5％的二氧化碳进行pH平衡控制。对于转瓶培养细胞，显然通过使用二氧化碳控制pH并不可行。通常可提高转瓶培养的初始pH来控制细胞培养的pH下限值，或者通过及时换液传代进行pH的有效控制。1.6.5 污染控制细胞培养过程中污染来源于三个方面，微生物污染、支原体污染、外源病毒污染。预防微生物污染对所有动物细胞培养来说都是一个重要的部分，可以通过有效的灭菌方法和高效的无菌技术以及抗生素来消除污染的风险。对于细胞转瓶低血清培养来说，由于细胞贴壁性的降低，在培养过程中，尤其是培养的中后期，游离的细胞较多，导致细胞培养液不是十分清亮，应注意和微生物污染情况的区分。如未发生微生物污染，游离细胞的存在并不影响细胞的培养传代效果。细胞培养中应经常检查支原体污染。支原体对于培养细胞的生长和功能有广泛的影响能与细胞竞争培养基中的营养物质，尤其会快速耗尽培养基中的精氨酸并增加氨的积累。氨基酸组分的耗尽和失衡对细胞培养造成了严重的后果。广泛存在的支原体污染，当污染程度增大到剧烈爆发时，会导致细胞低血清培养的失败。在使用转瓶大规模培养细胞时，由于使用血清等动物来源蛋白物质以及其它因素，有时会导致外源病毒的污染。在细胞低血清适应和培养过程中，外源病毒的污染也会导致培养的失败。使用受到外源病毒污染的细胞进行低血清培养时，由于病毒繁殖传代爆发需要一个时间过程，细胞传代过程中表现为细胞逐步死亡，通常会误认为是由于降低血清的结果，而忽视了外源病毒污染的影响。本实验室曾尝试使用产生轻微划痕的转瓶BHK21细胞进行低血清培养。使用方瓶静止培养，10％血清含量，细胞形态正常，之后直接降低为4％血清含量，培养两代细胞依然正常，但在传第三代时，细胞出现园缩死亡现象，同时正常10％血清含量的对照细胞也同样死亡现象。将该细胞培养物接种正常Vero细胞进行培养，引起Vero细胞病变死亡，证实为外源病毒污染。 

划线样BHK21细胞22小时照片（10%血清，第6代）  划线样BHK21细胞48小时照片（10%血清，第6代）划线样BHK21细胞22小时照片（4%血清，第6代）  划线样BHK21细胞48小时照片（4%血清，第6代） 划线样BHK21细胞24小时照片（10%血清，第8代）  划线样BHK21细胞24小时照片（4%血清，第8代）

编辑： tong202    来源：默克密理博北京清大天一